Жак Дюбоше, Йоахим Франк, Ричард Хендерсон
112.ua

Жак Дюбоше, Йоахим Франк и Ричард Хендерсон объявлены лауреатами Нобелевской премией по химии за 2017 год. Награда присуждена им за разработку эффективного метода построения трехмерных изображений "молекул жизни". При помощи созданной ими криоэлектронной микроскопии ученые теперь могут замораживать биомолекулы в движении и отображать их на своем оборудовании с точностью до атома. Эта технология привела к началу новой эры в биохимии

В последние годы в научной литературе появилось подробное описание множества удивительных структур живой молекулярной машинерии. К примеру, игла сальмонеллы, с помощью которой та атакует клетки. Или белок, который придает клеткам устойчивость к химиотерапии или антибиотикам. Были "сфотографированы" молекулярные комплексы, регулирующие циркадные ритмы (об этих ритмах подробнее в статье о Нобелевской премии по медицине), светозахватывающий комплекс, участвующий в фотосинтезе у растений, и сенсор давления, который одновременно помогает людям слышать. И это всего лишь несколько примеров из великого множества биомолекул, которые удалось увидеть при помощи криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ).

a) протеиновый комплекс, регулирующий циркадный ритм, b) сенсор давления, необходимый для слуха c) вирус Зика
Нобелевский комитет

Когда исследователи в Бразилии начали подозревать, что вирус Зика вызвал в стране эпидемию, из-за которой на свет стали появляться младенцы с серьезным повреждением мозга, они использовали крио-ЭМ, чтобы визуализировать невидимого врага. В течение нескольких месяцев ученые изучали трехмерные изображения этого вируса, сгенерированные с разрешением атомного масштаба, чтобы найти в нем уязвимое место – потенциальную цель для фармацевтических препаратов.

Изображение – важный ключ к знанию

В первой половине ХХ века биомолекулы – белки, ДНК и РНК – были terra incognita на карте биохимии. Ученые знали, что они играют фундаментальные роли в клетках, но понятия не имели, как выглядели эти молекулы. Только в 1950-х годах, когда исследователи из Кембриджа начали подвергать кристаллы белка рентгеновскому излучению, впервые удалось визуализировать их извилистые и спиральные структуры.

В начале 1980-х годов использование рентгеновской кристаллографии было дополнено использованием спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР) для изучения белков в твердом состоянии и в растворе. Этот метод не только раскрыл их структуру, но также показал, как они перемещаются и взаимодействуют с другими молекулами.

Благодаря этим двум методам ученые сегодня располагают базами данных с информацией о тысячах моделей молекул, которые используется повсеместно – от фундаментальных исследований до развития фармацевтики. Однако оба метода имеют серьезные ограничения. ЯМР в растворе работает только для относительно небольших белков. Для рентгеновской кристаллографии требуется, чтобы молекулы образовывали хорошо организованные кристаллы, такие, как замерзшая до состояния льда вода. Кроме того, полученные с помощью этих методов изображения больше похожи на старинные черно-белые портреты – они неподвижны и очень мало рассказывают о динамике белка.

Кроме того, многие молекулы не выстраиваются в кристаллах, а это привело в 1970-е годы к тому, что Ричард Хендерсон отказался от рентгеновской кристаллографии. И именно с этого момента начинается история Нобелевской премии 2017 года по химии.

Проблемы с кристаллами заставляют Хендерсона пойти другим путем

Ричард Хендерсон получил докторскую степень в стенах бастиона рентгеновской кристаллографии – Кембриджского университета в Великобритании. Он использовал метод визуализации белков, но проблемы возникали, когда он пытался кристаллизовать белок, естественным образом встроенный в мембрану, окружающую клетку.

Мембранные белки, когда их удаляли из естественной среды – клеточной мембраны, – часто собирались в непригодную для изучения массу. Первый мембранный белок, с которым работал Ричард Хендерсон, трудно было производить в достаточных количествах; второй не смог кристаллизоваться. После долгих лет разочарований он обратился к единственной доступной альтернативе – электронному микроскопу.

Действительно ли электронная микроскопия была эффективной в то время – до сих пор открытый вопрос. Просвечивающий электронный микроскоп, доступный тогда ученому, работал по принципу обычного микроскопа, только пропускал через образец не луч света, а пучок электронов. Длина волны электронов намного короче, чем у света, поэтому электронный микроскоп может делать видимыми очень маленькие структуры – даже распознавать положение отдельных атомов.

Теоретически разрешение электронного микроскопа было более чем достаточным для Хендерсона, который пытался изучить атомную структуру мембранного белка, но на практике это оказалось почти невозможным. Когда в 1930-х годах был изобретен электронный микроскоп, ученые считали, что он подходит только для изучения мертвой материи. Мощный электронный пучок, необходимый для получения изображений с высоким разрешением, сжигал биологический материал, а более слабый делал изображение нечетким и недостаточно контрастным.

Вдобавок электронная микроскопия требует вакуума – условия, при котором биомолекулы разрушаются, потому что окружающая их вода испаряется. Они высыхают и теряют свою естественную структуру, что делает полученное изображение непригодным.

Почти все обстоятельства указывали на то, что Ричард Хендерсон потерпит неудачу в своих исследованиях. Но неожиданно проект спас специальный белок, который он выбрал для изучения. Это был бактериородопсин.

Новости по теме: Космический щебет гравитационных волн. За что дали Нобелевскую премию по физике в 2017 году

Лучших технологий оказалось недостаточно для Хендерсона

Бактериородопсин – это белок фиолетового цвета, встроенный в мембрану организма, осуществляющего фотосинтез. Задача этого белка – захватывать энергию солнечных лучей. Вместо удаления чувствительного белка из мембраны, как ранее пытался это сделать Ричард Хендерсон, он и его коллега взяли целую фиолетовую мембрану и положили ее под электронный микроскоп. Так белок оставался в своей естественной среде и сохранял структуру. Для защиты образца от высыхания в вакууме исследователи покрыли его поверхность раствором глюкозы.

Безжалостный пучок электронов был проблемой, но ученые воспользовались тем, как молекулы бактериородопсина упаковываются в мембрану организма. Вместо того, чтобы взорвать его полной дозой электронов, они пустили более слабый луч через образец. Изображение было недостаточно контрастным, и разглядеть отдельные молекулы не получалось. Но ученые воспользовались знанием того, что эти белки обычно располагаются и ориентируются в мембране в одном направлении. Когда все белки отразили пучок электронов практически идентичным образом, они смогли просчитать более детализированное изображение на основе дифракционной картины. Похожий математический подход был использован и для рентгеновской кристаллографии.

На следующем этапе исследователи развернули мембрану под электронным микроскопом, снимая ее с разных ракурсов. Таким образом, в 1975 году удалось создать грубую трехмерную модель структуры бактериородопсина, которая показала, как белковая цепь несколько раз прошла сквозь мембрану.

Это было лучшее изображение белка, когда-либо созданное с помощью электронного микроскопа. Многие были впечатлены разрешением в 7 ангстрем (0,0000007 миллиметра), но этого было недостаточно для Ричарда Хендерсона. Его целью было достичь разрешения такого же, как при рентгеновской кристаллографии, примерно в 3 ангстрема, и он был убежден, что электронная микроскопия может этого добиться.

Хендерсон получает первое изображение с разрешением атомного масштаба

В последующие годы электронная микроскопия постепенно усовершенствовалась. Были улучшены линзы, развивалась криотехнология (мы вернемся к этому). Образцы для исследования стали охлаждать жидким азотом, защищая их таким образом от повреждения пучком электронов.

Ричард Хендерсон постепенно добавлял новые детали к модели бактериородопсина. Чтобы получить максимально четкие изображения, он ездил по миру, чтобы поработать в лабораториях с самыми лучшими электронными микроскопами. У каждого из них были свои недостатки, но они дополняли друг друга. Наконец, в 1990 году, через 15 лет после публикации первой модели, Хендерсон достиг своей цели и смог представить структуру бактериородопсина в разрешении атомного масштаба.

Таким образом, он доказал, что крио-ЭМ может обеспечивать изображения столь же детализированные, как и при использовании рентгеновской кристаллографии. Это была важная веха. Тем не менее, весь прогресс был построен на частном случае: естественном расположении белка в мембране. Совсем немного других белков самопроизвольно располагаются таким образом. Встал вопрос обобщения метода: можно ли использовать электронный микроскоп для создания трехмерных изображений с высоким разрешением для белков, случайным образом рассеянных в образце и ориентированных в разных направлениях? Ричард Хендерсон полагал, что можно, в то время как другие ученые считали это утопией.

На другой стороне Атлантики, в Департаменте здравоохранения штата Нью-Йорк, Йоахим Франк долго работал над решением именно этой проблемы. В 1975 году он представил теоретическую стратегию, в которой возможно минимальная информация, обнаруженная на двухмерных изображениях с электронного микроскопа, может быть объединена для создания трехмерной картинки с высоким разрешением. Ему потребовалось более десяти лет, чтобы воплотить эту идею.

Новости по теме: Как работают биологические часы организма. За что дали Нобелевскую премию по медицине в 2017 году

Франк улучшает анализ изображений

Стратегия Йоахима Франка была основана на способности компьютера различать следы случайно расположенных белков и их фона в нечетком изображении, полученном с электронного микроскопа. Он разработал математический метод, который позволил компьютеру идентифицировать разные повторяющиеся шаблоны в изображении. Затем компьютер отбирал аналогичные шаблоны в одну группу и объединял полученную информацию для создания усредненного более четкого изображения. Таким образом, он получил ряд двумерных изображений в высоком разрешении с одним и тем же белком, но под разными углами. Алгоритмы для соответствующего программного обеспечения были завершены в 1981 году.

Следующим шагом было математическое определение того, как разные двумерные изображения соотносились друг с другом и создание на их основе трехмерного изображения. Франк опубликовал эту часть метода анализа изображений в середине 1980-х годов и использовал ее для создания модели поверхности рибосомы, гигантского молекулярного механизма, который строит белки внутри клетки.

Метод обработки изображений Йоахима Франка стал основополагающим для развития крио-ЭМ. А мы пока вернемся на несколько лет назад – в 1978 год. Пока Франк совершенствовал свои компьютерные программы, Жак Дюбоше был нанят в Европейскую лабораторию молекулярной биологии в Гейдельберге для решения других основных проблем электронной микроскопии. Его задачей было выяснить, как биологические образцы высыхают и повреждаются при воздействии вакуума.

Дюбоше делает из воды стекло

метод стеклования воды Жака Дюбоше
Нобелевский комитет
Как мы помним, в 1975 году Хендерсон использовал раствор глюкозы для защиты своей мембраны от обезвоживания, но этот метод не работал для водорастворимых биомолекул. Другие исследователи пытались заморозить образцы, потому что лед испарялся медленнее, чем вода, но кристаллы льда так разрушали пучки электронов, что получавшиеся изображения выходили негодными.

Испаряющаяся вода была главной дилеммой. Однако Жак Дюбоше увидел потенциальное решение: охлаждать воду надо было настолько быстро, чтобы она затвердевала в жидкой форме, образуя вместо кристалла стекло. Стекло кажется твердым материалом, но по сути является жидкостью, потому что имеет неупорядоченную молекулярную структуру. Дюбоше понял, что если он сможет получить этот материал, также известный как остеклованная вода, пучок электронов будет рассеиваться равномерно и обеспечивать однородный фон.

Первоначально исследовательская группа пыталась застекловать крошечные капли воды в жидком азоте при -196 °С, но смогла добиться успеха только когда заменила азот этаном, который, в свою очередь, охлаждался жидким азотом. После этого они увидели под микроскопом каплю, которая не была похожа ни на что из того, что они видели ранее. Сначала ученые предположили, что это этан, но когда капля слегка нагрелась, молекулы внезапно перестроились и сформировали привычную структуру кристалла льда. Это был триумф – особенно с учетом того, что некоторые исследователи отрицали возможность как-либо остекловать капли воды. К слову, теперь мы считаем, что остеклованная вода является наиболее распространенной формой воды во Вселенной.

Простой способ контрастирования

После прорыва в 1982 году исследовательская группа Дюбоше быстро разработала основы техники, которая до сих пор используется в крио-ЭМ. Они растворяли в воде биологические образцы – изначально разные формы вирусов. Затем раствор распределяли в виде тонкой пленки по мелкой металлической сетке. Используя специальную конструкцию, они помещали сетку в жидкий этан, чтобы тонкая пленка воды остекловалась.

В 1984 году Жак Дюбоше опубликовал первые изображения ряда различных вирусов, круглых и шестиугольных, которые резко контрастируют с фоном остеклованной воды. Биологический материал теперь можно было относительно легко подготовить для электронной микроскопии, и исследователи вскоре начали обращаться к Дюбоше с просьбой обучить их новой технике.

От "каплелогии" к революции

Таким образом были изобретены все важные составляющие крио-ЭМ, но изображения по-прежнему имели низкое разрешение. В 1991 году Йоахим Франк подготовил рибосомы по методу остекловывания Дюбоше и проанализировал изображения с помощью своего программного обеспечения. Он получил трехмерную структуру с разрешением 40 ангстрем. Это был невероятный шаг вперед для электронной микроскопии, но изображение показало лишь контуры рибосомы. Больше всего она была похожа на обычную каплю, а само изображение даже не приблизилось к разрешению атомного масштаба, как в рентгеновской кристаллографии.

Поскольку крио-ЭМ редко могла визуализировать что-либо отличное от неровной поверхности, ее иногда называли "каплелогией". Тем не менее, со временем каждая гайка и болт электронного микроскопа постепенно оптимизировались. Во многом благодаря упорной работе Ричарда Хендерсона, который продолжал верить в то, что однажды электронная микроскопия сможет обеспечивать изображения, демонстрирующие структуру молекул до последнего атома. Разрешение улучшалось ангстрем за ангстремом, и последняя техническая трудность была преодолена в 2013-м, когда появился новый тип электронного детектора.

разрешение снимка молекулы до 2013 года и сейчас
Нобелевский комитет

Каждый скрытый уголок клетки становится видимым

Теперь, когда мечта трех визионеров стала реальностью, мир столкнулся с бурным развитием биохимии. У крио-ЭМ оказался ряд преимуществ, которые сделали его настолько революционным. Например, метод стеклования Дюбоше относительно прост в использовании и требует минимального размера образца. Кроме того, из-за быстрого процесса охлаждения биомолекулы могут быть заморожены посреди совершаемого ими действия, и исследователи могут получать серии изображений, показывающих разные его стадии. Таким образом получаются "фильмы", демонстрирующие движение белков и их взаимодействие с другими молекулами.

Используя крио-ЭМ, также легче, чем когда-либо раньше, отображать крупные молекулярные комплексы и упомянутые ранее мембранные белки, которые часто действуют как мишени для фармацевтических препаратов. Тем не менее, небольшие белки до сих пор не могут быть изучены с помощью электронной микроскопии, но их можно визуализировать с помощью ЯМР-спектроскопии или рентгеновской кристаллографии.

После того, как Йоахим Франк представил стратегию своего общего метода обработки изображений в 1975 году, он написал: "Если бы такие методы были усовершенствованы, то, по словам одного ученого, небо было бы пределом". И вот этот день настал – только небо стало пределом. Жак Дюбоше, Йоахим Франк и Ричард Хендерсон своими исследованиями принесли "наибольшую пользу человечеству" (а именно эта формулировка содержится в завещании Альфреда Нобеля). Каждый уголок клетки может быть отображен с точностью до атома, а перед биохимией открывается удивительное будущее.

Перевод материалов Шведской королевской академии наук.